带有基因剪刀的工具猪

　　新一期美国《国家科学院学报》报告说，美国科学家最近利用“基因剪刀”工具，培育出多个性状发生改变的埃及伊蚊，这些蚊子“外观呈黄色、有三只眼睛、翅膀发育畸形”。该研究旨在通过基因改造来阻断蚊子传播疾病。但培育一只畸形的蚊子究竟如何造福人类?很多人对“基因剪刀”在基因工程研究中的作用并不理解。

　　近年来，我国科学家在“基因剪刀”研究方面收获甚丰，继2015年中山大学黄军就成功修改人类胚胎的一个基因，阻止了这一基因的突变导致地中海贫血症并因此获国际盛誉后，中国科学院广州生物医药与健康研究院又联手南京大学南京生物医药研究院、广州医药研究总院等科研单位，攻克犬体细胞克隆难题，成功培育出世界首例肌肉生长抑制素基因敲除犬，近期该研究院还宣布培育出体内自带“基因剪刀”的工具猪，并顺利在三个月内成功建立起大动物原发性肺癌模型。

　　尽管还存有争议，但“基因剪刀”技术的研究仍有了许多实质性进展，相信不久就会实实在在地造福人类。

　　A “基因剪刀”技术飞速发展

　　名为CRISPR/Cas9的新型基因编辑技术，俗称“基因剪刀”，在2015年已被美国《科学》杂志公布为“2015年十大科学突破”之首。该技术2012年才被科学家发现，就迅速成为生物医学史上第一种可高效、精确、程序化地修改细胞基因组包括人类基因组的工具。2015年4月，我国中山大学科学家黄军就宣布在全球首次利用“基因剪刀”技术成功修改人类胚胎的一个基因，阻止了这一基因的突变导致地中海贫血症。当年黄军就便因此入选英国《自然》杂志“年度十大科技人物”。

　　“基因剪刀”全名应为“成簇的、规律间隔的短回文重复序列”，是细菌防御病毒入侵的一种机制。不同于传统的基因修饰技术，“基因剪刀”可以驾驭细菌的免疫系统、截断甚至破坏单个基因，然后在它们的相应位点上插入新的基因。当人们慢慢探究到基因的不同组合形式、不同表达、不同功能，再利用此工具进行“各个击破”，“从治疗人类各种病症，到解开物种灭绝之谜”，生物学科的各个领域问题都可能因此逐步迎刃而解。

　　尽管还有不少人在担心该技术未来是否会导致出现“定制婴儿”(即从胚胎细胞中敲除某些不好的特定性基因从而培育出理想化的婴儿)等伦理问题，但一些相关技术其实已开始运用到与我们生活息息相关的农业、军事、环保、医疗等各种领域。比如科学家已经使用“基因剪刀”成功进行了改良小麦和西红柿的实验，还生产出抗白粉病(最普遍的枯萎病之一)的小麦，等等。

　　正如《科学》杂志执行新闻编辑约翰·特拉维斯当年所言：“无论好坏，我们现在都已生活在‘基因剪刀’技术的世界里。”

　　B 中国科学家贡献卓越

　　中国科学家在这方面尤其做出了卓越的贡献。

　　2015年，黄军就曾告诉《自然》杂志，他编辑人类胚胎(医院废弃的有缺陷胚胎)基因，是希望“它能揭示癌症或糖尿病等疾病的基因根源，还能用来研究胚胎发育过程中各基因的功能”。

　　另一位在哈佛大学做博士后研究的中国学者杨璐菡，则和美国同事一起敲除了猪基因组中的62个病毒基因，扫清了猪器官用于人体移植的重大难关，为全世界需要器官移植的上百万病人带来希望。

　　2014年6月底时，由中国科学院广州生物医药与健康研究院联合南京大学南京生物医药研究院、广州医药研究总院等科研单位共同培育的“世界首例肌肉生长抑制素基因敲除犬”诞生了。到15个月左右，这两只名叫“大力神”与“天狗”的基因敲除犬已明显表现出远比同龄的狗更强壮矫健，运动力更强。该研究团队因此在世界上首次建立起了狗的基因打靶技术体系。2017年5月28日世界首例基因敲除体细胞克隆犬“龙龙”的诞生，更标志着我国成为继韩国之后第二个独立自主掌握犬体细胞克隆技术的国家。

　　2017年11月16日，中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学领导的课题组在《基因组研究》在线发表了最新研究成果，研究人员首次构建了新型条件性表达Cas9基因工具猪模型。他们利用基因打靶技术，成功地在猪体内加入了一把“基因剪刀”，并定位了一个“开关”(详见“链接”说明)，让研究者在研究中能更自如地对其剪切功能的开启加以控制。利用这样的工具猪模型，可高效地实现大动物体内细胞单基因、多基因、超大片段基因的编辑，也让中国科学家率先实现了直接对成体大动物进行体内基因编辑，并首次建立了大动物原发性肺癌模型。在“基因剪刀”技术的研究中，这无疑是再推进了一大步。

　　C 从科研到实际应用仍待思考

　　一只只特殊的“基因敲除”动物的诞生，意味着“基因剪刀”技术的突飞猛进。为什么还是有人对这种技术应用于我们的日常生活心存质疑呢?

　　这里不想细谈“定制婴儿”这类有关伦理方面的担忧，先回到我们开篇提到的美国科学家培育的“基因敲除埃及伊蚊”。据研究人员称，目前这个实验只是第一步，他们的长期目标是以体内稳定表达Cas9酶的蚊子为载体，插入和扩散目标基因——比如会破坏繁殖能力的基因等，从而控制蚊虫数量，减少疾病传播。这的确是一种既环保，成本又更低的防蚊灭蚊手段。但它何时才能真正应用到我们的生活中呢?

　　其实，类似的研究一直在进行中。本世纪初，就有英国牛津大学卢克·阿尔菲博士团队发明的一种控制害虫种群的方法，是将一种致死基因转染到昆虫基因组中，在特定条件下，这种致死基因会刺激转基因昆虫体内产生大量毒素，最后导致转基因昆虫幼虫死亡。2007年，卢克·阿尔菲教授团队首次公开了利用上述技术培育出了转基因不育埃及伊蚊雄蚊，还开展了一系列野外放飞试验，来验证这种不育蚊子能否控制埃及伊蚊种群数量。到2016年8月，美国FDA出具了报告，认为这种转基因伊蚊的放飞对人和环境没有安全风险，却至今仍对批准该转基因伊蚊在美国的商业化应用一再犹豫。甚至有人提出，某种蚊子的灭绝是否会导致以此蚊为食的其他动物灭绝，从而破坏生态平衡呢?另外，这些转基因蚊子的后代会不会因基因改变而打破和扰乱了它们与宿主的免疫系统之间某种平衡，从而间接地触发了另一个毫不相干的病毒复苏和传播呢?

　　这种质疑与所谓的“定制婴儿”的伦理观相比，显然是关于基因工程的又一个层面的担忧。相信相关的其他问题还会慢慢显现。

　　总之，从第一只“克隆羊”到如今的“基因剪刀”，基因工程研究的发展已远超乎我们的想象，但它如何顺利地、广泛地应用到我们的生活中，仍然是个值得深思的问题。

　　修改基因让猪想病就病?

　　由于猪在器官结构、大小以及生理代谢、免疫系统等方面与人更加接近，被普遍认为是非常理想的大动物疾病模型、异种器官移植供体模型和异种器官再造受体模型。要获得这些模型，需要对猪的基因组进行编辑。

　　之前，对猪等大动物在体内直接进行基因突变在技术上尚不可行。猪的基因组编辑主要依赖于受精卵注射或体细胞核移植技术来实现。但受精卵注射方式建立基因编辑动物却易产生嵌合体，需要繁殖到第二代，甚至第三代，要花2-3年的时间才能够获得有实际用途的基因编辑猪。而利用体细胞核移植技术制备基因编辑大动物模型，又因多种不可控等因素影响，体细胞克隆成功率非常低，同样耗时、耗力，且成本极高。

　　如今研究人员利用基因打靶技术，成功地将能够剪开基因的Cas9蛋白基因插入到猪基因组的一个特定的位点(ROSA26)，相当于在猪体内加入了一把“基因剪刀”，并且在Cas9基因附近加上了能与Cre重组酶结合的loxp位点，后者相当于一个开关，能对其剪切功能的开启加以控制。利用此工具模型，不需要依赖受精卵注射或体细胞核移植技术，研究人员就能在动物体内转入能识别特定基因的gRNA和重组酶，可直接对猪的基因组进行编辑，从而快速获得相应基因编辑猪模型。

　　研究人员将包装的含有Cre重组酶和靶向六种肿瘤相关基因的gRNAs慢病毒通过滴鼻方式，感染了“工具猪”的肺脏，在猪肺细胞的基因组发生癌化突变。三个月后，猪出现了典型的肺癌症状和病理变化，从而成功地建立了原发性肺肿瘤大动物模型。

　　这一研究成果将推动猪基因功能的研究进展，加快了在生物医药及农业领域有重要应用价值的基因修饰猪模型的建立。

　　“克隆犬”得来更不易

　　说到“克隆”这个词，很多人会想到世界上第一例运用这项技术培育出的动物——克隆羊“多莉”。它标志着生物体通过体细胞进行无性繁殖的克隆技术成为现实。随后，克隆猪、牛等纷纷问世，而克隆犬直至2005年才问世。

　　因为犬被科学界普遍认为是最难克隆的动物之一。

　　韩国是第一个成功培育出克隆犬的国家，2005年，世界首例体细胞克隆犬“史努比”在韩国诞生。直到2017年5月28日，中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员带领希诺谷公司科研团队及广州生物院实验室团队，在首先获得两只基因编辑犬“苹果”和“葫芦”后，又以“苹果”体细胞作为克隆犬供体细胞，成功培育出“苹果”的克隆犬“龙龙”，这才标志着我国成为继韩国之后第二个独立掌握犬体细胞克隆技术的国家。

　　犬体细胞克隆困难重重

　　克隆犬的首要问题是如何获得足够数量成熟卵母细胞。

　　猪、牛、羊等动物通过体外成熟培养技术，可获得大量的成熟卵母细胞，而犬卵母细胞体外成熟培养效率极低，只能从体内获取成熟卵母细胞。体内成熟卵母细胞的获取，需要精确掌握犬发情排卵时间，一旦错过一次发情排卵时间，就需要等上半年或一年才有下一次机会。准确把握排卵时间十分困难，通过血清测定孕激素的个体间差异大，难以确立一个统一的评判标准。时间过早，卵母细胞未成熟;时间过晚，卵母细胞已老化。

　　其次，一只犬平均每次排卵七八枚，排出的卵子处于GV期，需要在输卵管内停留48-72h到达MⅡ期。犬卵母细胞中富含脂类物质，颜色较深，黏性很大，显微操作较困难，体细胞电融合效率不高。

　　最后，犬胚胎移植中，受体与供体间在生殖生理阶段上难以保持一致性。妊娠率低，再加上克隆技术本身的低效率问题，使得犬体细胞克隆更是难上加难，需要投入大量的财力、人力和物力。

　　“龙龙”的诞生

　　2013年，一种新的基因编辑技术(CRISPR/Cas9)风靡全球，它具有构建简单方便、基因打靶效率高等特点，可以让基因想要就要、想没就没，随心所欲。很快，已成功在牛、羊、猪、兔、小鼠、大鼠等动物及人类胚胎中实现了基因修饰。但它是否同样能在犬基因组中发挥作用?实验过程并非一帆风顺。

　　几经周折，几次更改实验方案，神奇的“基因剪刀”终于发挥了神奇的功能。2014年6月底，世界首例基因(MSTN)敲除犬“大力神”与“天狗”诞生。四个月时，“大力神”与“天狗”就表现出超强运动能力，且“天狗”还具有明显“双肌”性状(两倍肌肉)。2016年12月29日，通过犬APOE基因敲除实验，世界首例动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”诞生。20天后，另一只APOE基因敲除犬“葫芦”也诞生了。

　　“苹果”出生后，它的皮肤细胞被保存了下来。之后研发人员用“苹果”的细胞进行体细胞克隆，经过几次实验后，在2017年5月28日，中国独立培育的首只克隆犬“龙龙”才终于诞生了，它同时也是世界首例基因敲除体细胞的克隆犬。之后又有另两只同样的克隆犬诞生。(中科院广州生物医药与健康研究院博士生 王晓民)